Question

反转录PCR中以第一链cDNA为模板合成第二链PCR时引物该怎么设，还有这个PCR的模板只有一条链为什么设

还有这个PCR的模板只有一条链为什么设上下游引物，并疑惑为什么一条模板也可以PCR？

Answer 1

引物是热稳定DNA聚合酶的结合位点，能够使子链合成时按照5’—〉3’的方向进行，不设置引物根本就没办法进行互补链的合成，因此尽管只有一条链也应该设置引物。一条模版合成了互补链后，在加热解链后，模板链和互补链均可再做下一次PCR合成的模版，按照指数增长方式快速的合成多个DNA。

追问

这我知道，如果是RT中不是有特异性引物方式扩增产物，这样的设引物该怎么设？

Answer 2

那是因为反转录酶的特性跟taq酶不一样啊，反转录的时候也是要加入N6或oligdT作为反转录引物的，确切的说反转录和PCR是不一样的两件事

追问

这我知道，如果是RT中不是有特异性引物方式扩增产物，这样的设引物该怎么设？

追答

一般选择模板3‘端设计，我有时会用qPCR的3’引物，只要设计一条就行了

Answer 3

第一链合成后，将mRNA水解，其水解后的片段充当了第二链的引物

Answer 4

1.第一次扩增后，cDNA不就变成两条了吗，从这里开始模版已经变成了两条链了。
2.从第二次扩增开始，已经和一般PCR没有区别了。所以还是参照普通PCR的条件