Question

有哪位大虾们能帮忙解释一下RT-PCR中引物的碱基序列中上游的Tm值和下游的Tm值不一样不一样是什么原因？

Answer 1

上游引物跟下游引物Tm值不一样是很正常的，在设计引物时根据ATGC碱基含量的不同来计算，上下游引物Tm值不一样时，根据Tm值低的来计算退火温度，祝你实验顺利！

Answer 2

你想问什么，能说具体点吗？你说你的上下游引物Tm值不同？那不是很正常嘛。。

追问

1就上下游不同Tm值，是很正常，问什么啊？对这方面不是很了解，求解释。2在做RT-PCR时，对于选择退火温度参照哪个Tm值呢，这个怎么计算？

追答

tm值你懂是啥意思咯？就是熔解温度，链的50%处于解链开的状态时的温度。计算Tm值的算法很多，最粗略的就是本科时候学的Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 。你看看这个公式，GC含量和AT含量决定了tm的高低。你要是刨根问底，说白了GC配对是三键，更难解开，AT更易于解开。OK？

还有你说的RT-PCR，你是指定量PCR还是反转录PCR的基因特定引物？麻烦说清楚。我默认你是指定量。这个你应该用相关软件设计（我们通用express 3.0），tm值只是引物的一方面，你还要保证其他比如二聚体呀等比较优良。最后一个小宗旨，上下游引物的tm差别不宜超过5（其实这些都是软件默认的值，不需要你去操心，超过了5度它会自动不要这对引物。现在的软件都是越来越傻瓜式的）。
我写了这么多，总该采纳吧。