Question

常用蛋白质沉淀方法有哪些？有哪些应用实例？

Answer 1

一般最常见的是盐析沉淀，就是在蛋白质溶液中加入一定量的硫酸铵，蛋白质便会沉淀下来，不同蛋白沉淀所需要的硫酸铵浓度不一样，通过这个方法也可以对蛋白进行初步的纯化分离。再有就是等电沉淀，通过调节蛋白溶液的pH，使其刚好达到目标蛋白的等电点，这时候蛋白分子将不带有电荷，在相互碰撞聚集过程中沉淀下来。与之类似的有通过加沉淀剂或絮凝剂比如明矾之类的，也可以沉淀蛋白。另外还有就是亲和沉淀，利用生物分子亲和力，比如抗原抗体亲和、酶与底物亲和等性质，将配对的另一半固定在某些介质，比如小磁珠上，就能将溶液里面的目的蛋白抓住沉淀下来。

Answer 2

沉淀可以是由蛋白质变性从而产生沉淀，也可以是由于盐析。
蛋白质变性是指光照，热，有机溶济以及一些变性剂（如重金属盐）的作用时蛋白质的空间结构被破坏，使得蛋白质丧失活性，该过程不可逆。
盐析是指向蛋白质的溶液中加入轻金属盐，使得蛋白质沉淀析出，这是由于加入盐降低了蛋白质得溶解度而析出，该过程可逆，加水蛋白质又会溶解。
（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

（四）样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。