Question

为什么要设计引物

Answer 1

问题一：PCR扩增时为什么需要引物呢? 因为DNA聚合时需要3‘OH，这个只能由引物提供（没原因，就因为是那样）。这个引攻是一小段RNA ，引物绝对是RNA，而不是DNA。看看DNA复制需要什么酶就知道了，需要依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）如果是DNA，那么复制的时候要引物干什么呢？我直接用互补脱氧核糖核酸就完了，干嘛还弄一引物，然后复制完再水解掉？本人生化学的还是不错的，别人都说难，我也不觉得。

问题二：怎么设计引物？ 5分 选择引物的一般规则
设计和选择引物时有5个要素必需注意。
1 引物的3′末端不互补 引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%，到－8时少于20%，而－10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。
2 引物分子内不互补 应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

3 引物的组分、解链温度和长度 普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。
4 引物的内部稳定性 在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。所以，有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal&#......>>

问题三：设计引物之前为啥要进行同源性比较？ 引物种类多了，看你设计哪种引物了。
如果你想在基因组或者cDNA上P一个基因，这个基因在物种上是一个家族，你肯定就要和本物种内其他家族成员进行比较，避开保守区，以免设计的引物P到那些基因。
你要是想尽可能地P整个家族的基因，同样你也得比较，找到它们共同的保守结构，在这上面设计引物。
也不是每种引物设计都要比对同源性。
还有很多情况，不能一概而论。你可以把你具体的情况补充说明一下。

问题四：为什么设计PCR引物时，后面那条引物设计出来后要反转？ 两条引物针对两条链设计，因为扩增的方向都是5‘-3’。每条引物针对一条链，这样整个PCR反应就两条链都合成出来了。所以设计的时候，第二条引物是用互补链为模板设计的，所以要反转。
用引物设计软件设计，很容易就搞清楚原理了，也不容易出错。

问题五：为什么设计引物G+C百分含量上下游引物要小于5 为什么设计引物G+C百分含量上下游引物要小于5
1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
2.产物不能形成二级结构。
3. 引物长度一般在15~30碱基之间。
4. G+C含量在40%~60%之间。
5. 碱基要随机分布。
6. 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7. 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8. 引物5′端可以修饰。
9. 引物3′端不可修饰。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。